蛋白酶K是已知的最活跃的内肽酶之一。该酶对天然蛋白非常有效，可用于快速灭活内源性rna酶和dna酶。蛋白酶K特别适合于分离核酸，用于扩增反应，从组织和细胞系中分离天然RNA和DNA，通过激活细菌自溶因子促进细胞裂解，以及修饰细胞表面的蛋白质和/或糖蛋白（用于膜结构分析）。
抑制剂：以下任何一种都不能使酶失活：金属离子，螯合剂（如EDTA），巯基试剂，或胰蛋白酶和凝乳胰蛋白酶抑制剂。
激活剂：变性剂（SDS和尿素）的存在刺激了蛋白酶K的活性。
注：SDS可使蛋白酶K活性增加7倍。
最佳pH值：蛋白酶K在较宽的pH范围内（4至12.5）是稳定的，如果在6.5至9.5之间的pH孵育，则可保持其充分活性数小时。
如果存在大量过量的蛋白质并且长时间孵育，这种酶可以将蛋白质还原为游离氨基酸。